EVs与LNPs分析技术专题：还原真实面貌，多模态形貌表征赋能药物递送与临床转化

细胞外囊泡（EVs）与脂质纳米颗粒（LNPs）作为现代药物递送领域的重要载体，在创新药物研发中持续发挥关键作用。依托先进的仪器矩阵与技术团队，中山大学分析测试中心针对脂质基纳米载体研究中的关键科学问题，构建起了“粒径→形貌→结构→组分”的全链条表征体系，为纳米药物研发提供硬件支撑与数据保障。

脂质基纳米载体（脂质体/LNPs/EVs）的形貌直接决定其体内循环时间、靶向性与药效，是评价运载能力的关键指标之一。然而，这类载体尺寸小、结构柔软易变形，不当的处理极易导致结构失真，选择合适的技术尤为关键。针对这类特殊样品的形貌与结构表征，常用表征手段主要包括：

一、负染电镜

利用磷钨酸或醋酸铀等重金属染料对样品进行负染，在颗粒周围形成高密度层增强反差，应用常规生物透射电镜进行观察。负染电镜可快速对脂质体粒径、形状、均一性甚至表面修饰情况进行表征（见图1）。
优势：
1、提供纳米级分辨率；
2、可区分单个囊泡与聚集体；
3、设备普及率高、制样快、成本低，特别适合样品的快速初筛。

图1. （a-c）利用负染电镜对不同来源的外泌体、脂质体进行表征，

（d）应用负染电镜证实目标EVs被成功捕获（详见往期推送）。

二、冷冻透射电镜

要实现外泌体等材料的冷冻电镜观察，需要先通过特殊的制样技术将样品固定。应用专用设备将液体样品快速投入液乙烷（约-180°C）中进行玻璃化冷冻，从而保留外泌体/脂质体等样品在液体环境中的原生形貌，最终转移到冷冻透射电镜中，进行形貌观察。
优势：
1、无需干燥、染色和化学固定，反映近生理状态下的真实形貌；
2、分辨率高，可解析单层、多层、立方相、cubosomes等复杂结构；
3、单次分析即可同时获取形貌、内部结构、粒径、药物包载状态等多重信息；
4、表征范围5-300 nm，配合冷冻断层扫描可获取3D结构信息。

图2 （a）应用冷冻电镜表征牙周膜干细胞外泌体形貌，可以观察到清晰的磷脂双分子层结构及外泌体内容物；

（b）利用冷冻电镜实现载药脂质体的粒径分布、形貌分布表征。

三、原子力显微镜

原子力显微镜主要利用探针针尖与样品表面之间的微弱原子间作用力，通过检测探针悬臂的偏转或振动频率变化，获得样品表面纳米级形貌及力学信息。

优势：
1、Z轴分辨率可达亚纳米级，提供精细的脂质体三维表面形貌（见图4）；
2、无需真空环境，可在空气或液相中原位分析样品，但需提前将样品牢固吸附/固定于平整基底；
3、独特优势：通过力学测量提供样品表面力学性能：杨氏模量、粘附力、粘弹性（恒高或恒力下测力松弛或蠕变）。

图4 应用原子力显微镜对外泌体的三维形貌与尺寸进行表征

图5 中心利用生物型原子力显微镜对脂聚合物纳米体的杨氏模量进行了系统表征，支撑丁建勋/陈进进团队产出高水平成果

四、小角散射

小角X射线散射（SAXS）利用X射线与样品内纳米尺度电子密度起伏作用产生的散射，在极小散射角（通常2θ < 5°）范围内采集散射信号，得到倒易空间散射强度分布，结合模型拟合解析出纳米结构特征与尺寸参数。

优势：
1、在溶液状态条件下获取结构信息，适合柔软、含水的脂质体系；
2、可精确测定双分子层厚度、层间距、药物晶体尺寸、回转半径（Rg）等，区分单层/多层结构；
3、通过特征散射峰判定层状相、六角相、立方相等复杂液晶相及长周期结构；
4、对大量颗粒整体取样，数据可重复性好，弥补电镜局部视野的统计偏差；
5、可进行温度扫描、时间分辨实验，追踪自组装动力学与相变过程。

图6 利用小角散射表征不同温度下脂质体的尺寸差异

五、设备详情

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